Nat Methods | 王友军/章晓辉/唐爱辉团队合作开发出新型的高灵敏钙离子探针

人的呼吸、运动及思考等生命活动都离不开钙离子 （Ca²⁺） 这种生死攸关的信号分子。细胞通过钙信号，即钙离子浓度在胞内的时空变化，来控制各种细胞活动。灵敏而准确的钙信号检测工具，对相关生命活动规律的探究至关重要。“遗传编码的钙离子指示剂” （genetically encoded Ca²⁺ indicators, GECI） 使得在体钙信号检测及细胞活动指示变得便捷可行，在领域内获得了广泛的应用。

GECI主要由钙感知和荧光反应两大模块组成。目前应用最广泛的GCaMP（2-8）系列，其钙感知部分包括钙结合蛋白 （如钙调蛋白CaM） 及其靶肽 （如M13/RS20） ，产生荧光变化的部分为环化重排的绿色荧光蛋白cpGFP （图1A） 。研究人员发现，改变CaM、M13与荧光蛋白三个元件之间的连接方式、连接短肽及互作界面中的关键氨基酸等方式，会改变GECI的表现。经过二十多年来的各种改造，研究者们逐步优化了GECI的灵敏度和反应速度，但它们的反应幅度，即对钙信号大小的分辨率始终有待提高。

2023年4月20日，北京师范大学的王友军团队、章晓辉团队与中国科技大学的唐爱辉团队等在Nature Methods上发表研究论文 Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity ， 开发了采用全新策略构建的新型高灵敏钙离子探针。

为了增强GECI对钙离子浓度变化的荧光响应，合作团队采用更亮的新型荧光蛋白mNeonGreen （mNG） 来替换广泛使用的cpGFP，构建了基于不同设计策略的几十种复合GECI分子。通过系统的钙离子成像筛选，优选出一组名为NEMO的新型GECI探针 （图1B） ，体外鉴定发现，NEMO相比现有的GCaMP系列探针具有更好的抗光淬灭能力与pH稳定性，并能实现对钙离子绝对浓度的定量检测。

图1、单荧光遗传编码钙探针（GECI）的常见构建方式。A) GCaMP方式；B）NEMO的构建方式。

本研究在非兴奋性细胞系 （图2A） 、原代培养的神经元 （图2B） 和小鼠脑内 （图2C） 等多种情况下，对NEMO的性能进行了系统测试。NEMO探针首次实现了对细胞内钙活动的超过100倍的荧光反应幅度。相比于最新的jGCaMP8f和最广泛使用的GCaMP6s，NEMO系列探针对胞内钙信号的反应速度相当，但更灵敏，具有更高的信噪比，且反应幅度提高约10倍。其中的NEMOf适合检测快速信号，NEMOs适用于小的钙信号变化，NEMOc适宜用更大的钙信号检测，而NEMOm则是一个更通用的版本。因而NEMO工具对胞内钙信号或钙依赖的细胞活动大小具有更高的分辨率，将为神经元活动及细胞钙信号的时空变化提供了一组更优的工具。

图2、NEMO钙探针在（A）非兴奋性细胞，（B）分离神经元及（C）小鼠在体脑神经元中的反应示例

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01852-9

制版人：十一

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