乳腺癌是当代女性最常见的恶性肿瘤，病死率在女性患癌中排名第二[1]。随着检测技术的进步以及生活水平的提高，近些年我国乳腺癌的发病率逐年升高，并且患病年龄呈低龄化趋势。乳腺癌的病理机制为乳腺上皮细胞在多种致癌因素的作用下发生基因突变，由正常乳腺细胞转变为肿瘤细胞。虽然目前乳腺癌在所有肿瘤中有较好的治疗效果及较长的生存期，但术后的复发转移仍是导致乳腺癌患者死亡的最大原因。因此乳腺癌的早期诊断和治疗对乳腺癌患者的预后有着重要意义，寻找敏感性和特异性更高的肿瘤标志物对乳腺癌的早期发现和预后评估有很重要的研究价值。
随着表观遗传学的发展，越来越多的研究人员发现DNA的修饰在乳腺癌发生发展中有着重要的作用。
肿瘤的发生是由一系列遗传和表观遗传的改变来调节的，异常的DNA甲基化修饰是肿瘤细胞的早期关键特征[2]，并且可以成为预测癌症风险的肿瘤标志物。DNA甲基化的过程通常是以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，并在DNA甲基转移酶（DNMT）催化作用下，将甲基转移到碱基上的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化修饰通常发生在胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）（CpG岛）中，胞嘧啶第5个碳原子被转化为5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mc）[3,4]。这些聚集的CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60%以上基因启动子含有CpG岛。因此，甲基化调控控制了特定基因的表达。DNA甲基转移酶主要有4种：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。DNMT1主要参与DNA复制过程中维持DNA甲基化[5]；DNMT3A和DNMT3B负责催化核酸链上新的甲基化位点发生反应，成为形成甲基化；DNMT3L不具有甲级转移酶活性，其主要作用是调节其他甲基转移酶的活性。
DNA甲基化对于哺乳动物中枢神经系统[6]的分化和成熟以及干细胞分化、X染色体失活和转位因子抑制[7]等至关重要。甲基化状态有3种：持续的低甲基化状态（如持家基因的甲基化）、诱导的去甲基化状态（如一些发育阶段特异性基因的修饰）和高度甲基化状态（如人类女性细胞内缢缩-失活的X染色体的甲基化）。在正常的细胞基因中，CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。但在基因印记或肿瘤发生等情况时，DNA上的这些CpG岛常常会发生甲基化。基因启动子的甲基化修饰通常导致基因表达失活。由此，DNA甲基化与癌症的发生密切相关，且多数发生在肿瘤早期。已有研究证明DNA甲基化与多种消化系统恶性肿瘤密切相关。以往研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤发生的机制及共同特征之一。全基因组低甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象[8]。然而，就单个基因来讲，常常高甲基化与低甲基化并存：抑癌基因启动子甲基化后其表达受抑制，失去抑制肿瘤细胞发展的功能，从而导致癌症的发生，例如抑癌基因MEG3基因启动子异常甲基化可能与肝细胞癌的发生有关。Rap1GAP启动子甲基化可能与结肠癌的发生、发展有关。低甲基化修饰通常发生在原癌基因启动子上，原癌基因激活，诱导细胞癌变。总之，全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化等DNA甲基化模式异常都有可能导致肿瘤的发生。
以往的研究发现多种抑癌基因启动子区的超甲基化与乳腺癌的发生发展相关。Qi和Xiong[9]发现视黄酸受体β2基因（RARβ2）、死亡相关蛋白激酶基因（DAPK）、错配修复基因（hMLH1）、p14和p15的高甲基化均会增加乳腺癌的易感性。有研究发现[10]，启动子三重基序蛋白9（TRIM9）在乳腺癌细胞系及乳腺肿瘤组织中均存在甲基化，而在正常乳腺组织中没有。细胞周期素D2基因（Cyclin D2）甲基化几乎只在乳腺癌组织中出现。有研究团队发现，血清DNA甲基化标志物EFC#93的检测结果能准确指出，有43%的女性可能发展为致命性乳腺癌且特异度为88%[11]。大量证据表明[12]，成对的同源域转录因子2（PITX2）基因的DNA甲基化可作为乳腺癌的预后和预测性生物标志物。较高的磷酸丝氨酸转氨酶1（PSAT1）甲基化水平与乳腺癌较长的无病生存期相关，而较高的转录因子叉头框蛋白A1（FOXA1）甲基化水平则其特异性生存期相对较短[13]。因此，这些基因都有可能作为乳腺癌早期诊断的标志应用于临床。并且DNA甲基化检测比传统检测方法更准确，有研究发现[14]，DNA甲基化修饰比体细胞拷贝数变异更能区分癌组织和正常组织。不同类型的乳腺癌甲基化也不尽相同，三阴性乳腺癌患者DNA甲基化水平明显高于健康人[15]。在雌激素受体（ER）阳性乳腺癌中，启动子DNA甲基化的缺失可能会导致miR-190b的上调，而miR-190b的低甲基化会导致Luminal A患者更好的生存率[16]。耳聋相关常染色体显性遗传5（DFNA5）甲基化在乳腺小叶癌的表达明显高于导管癌[17]。乳腺癌中不同组织中基因的甲基化也有差异，如波形蛋白（VIM）、DKK3和细胞维甲酸结合蛋白1（CRABP1）在大多数上皮性乳腺癌细胞系中甲基化，而粒状头样2（GRHL2）、miR-200c和上皮-钙粘连素基因（CDH1）的甲基化仅限于间充质细胞系[18]。Liu等[19]发现原钙黏蛋白10基因（PCDH10）甲基化与肿瘤大小相关。在乳腺癌中DNA通常呈现广泛低甲基化，并且随着恶性程度的增加而渐进性增加[20]。有研究发现，与正常组织相比，程序性死亡受体1（PD-1）、白细胞分化抗原4（CTLA-4）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）启动子区域的CpG岛在肿瘤中明显低甲基化[21]。总之，DNA甲基化可以作为判断乳腺癌预后的重要指标[22]。
有研究表明，雌激素受体α（ERα）与ERβ基因启动子区甲基化是导致其基因功能失活的主要原因[23]。用去甲基化试剂处理乳腺癌细胞，ER基因CpG岛部分脱甲基化，ER表达增加。因此，乳腺癌细胞中ESR1启动子甲基化的分析有助于为乳腺癌患者设计更合适的内分泌治疗的靶点[24]。目前临床上主要的抑制甲基化修饰的药物是DNMT抑制剂，胞嘧啶类似物5-氮胞苷及其脱氧核糖类，主要应用于血液学方面的肿瘤。对于像乳腺癌这种实体肿瘤尚未达到理想的治疗效果。
2009年，5-hmc第一次在小鼠浦肯野神经元和胚胎干细胞中发现[25,26]。5-hmc是由胞苷加氧酶的11个易位蛋白（TET1，2，3）家族作用于5-hmc羟基化产生的[27]。人体各器官中5-hmc的含量不同。例如，脑组织细胞5-hmc含量最高0.67%，而胎盘和乳腺组织含量最低，分别为0.06%和0.05%[28]。5-hmc通过甲基化胞嘧啶的氧化产生，然后可以在胸腺嘧啶DNA糖基化酶和去甲基酶共同作用下逆转5-hmc修饰。因此，它是DNA主动去甲基化修饰的关键中间环节。并且可能与基因表达的激活相关。
肿瘤相关的DNA甲基化研究已经被广大研究人员所关注，而羟甲基化的研究目前还处于较为空白阶段。目前，只有少数研究涉及羟甲基化。Neri等[29]通过上调表达TET1蛋白结合到DKK启动子区域，介导DKK的CpG甲基化变为去甲基化，从而抑制结肠癌的进展。5-hmc的整体缺失是慢性淋巴细胞白血病发病的新标志[30]。在乳腺癌中相关研究较少，有研究发现，高分化的癌细胞中羟甲基水平明显高于低分化的癌细胞[31]。肿瘤抑制基因假定肿瘤抑制亮氨酸拉链蛋白1（LZTS1）在乳腺癌组织中羟甲基化也较正常乳腺低[32]。
大量研究表明，在正常细胞向癌症细胞转化时，DNA的甲基化明显早于其他表观遗传学改变。因此，DNA甲基化检测可以作为癌症的早期诊断标志物、治疗靶点以及预后评估标准。与其他诊断方法相比，DNA甲基化检测具有早期、敏感等优点。治疗上通过药物改变异常甲基化状态就有可能使基因恢复表达。因此，通过基因治疗去甲基化恢复抑癌基因的抑癌作用或者降低癌基因的活性来抑制肿瘤生长可以成为一种新的治疗手段[33]。例如，通过抑制DNMT1使DNA去甲基化的地西他滨目前已在临床上用于治疗骨髓增生异常综合征，但对于其他肿瘤还在试验中。
5-hmc作为去甲基化途径中的重要环节，同样也可作为治疗靶点以及预后评估标准。但目前对于羟甲基化作用机制的研究还尚未明确，以及去甲基化的过程及与疾病的关系也仍需要科研人员的进一步关注。
乳腺癌是全球女性死亡的主要原因。乳腺癌发展过程涉及多个基因的异常表达，DNA甲基化及羟甲基化在基因调控、蛋白质表达以及个体发育过程中起到重要作用。因此，掌握乳腺癌基因甲基化及羟甲基化修饰水平与基因表达的联系，将有助于深入了解乳腺癌的发展机制。然而，乳腺癌的发病是由多基因多因素参与的，DNA甲基化只是因素之一，故还不能作为确诊或第一诊断手段。而且，目前对DNA甲基化及羟甲基化与肿瘤发生发展之间的关系仍然知之甚少。但相信随着科研人员的努力以及检测技术的进步，DNA甲基化及羟甲基化在乳腺癌中的作用将会更加被人们所熟知，并且最终应用到临床。
引用本文: 倪清涛, 潘驰. DNA甲基化与羟甲基化在乳腺癌中的研究进展 [J] . 肿瘤研究与临床,2020,32 (02): 130-133. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2020.02.014
作者：
江苏省泰州市人民医院肿瘤科 倪清涛
江苏省泰州市人民医院甲乳外科 潘驰
参考文献略
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