Nat Chem Biol | 曹雄文等利用新的蛋白质组学鉴定方法揭示核糖体大亚基组装质量检测开关

人类基因组的注释（annotation）是基于一定的规则【1】，包括①小于100个氨基酸的开放阅读框不被翻译；②一条mRNA翻译一个蛋白质；③翻译的起始密码子必须是AUG。研究表明这些规则都有例外，暗示人类基因组注释不完整。与此一致的是，核糖体足迹（Ribosome foot-printing）实验发现【2】有①50%的人基因在其5'非编码区有翻译起始；②27%的人基因在其3'非编码区有翻译起始；③4%的人长非编码RNA有翻译起始，并发现绝大多数这些翻译都能产生小蛋白质（小于150个氨基酸），暗示人类基因组忽视了很多小蛋白质。小蛋白质（比如干扰素、激素）在很多生物学过程中有重要功能,暗示未注释小蛋白质（unannotated small proteins）也有类似的重要功能。事实也如此，比如敲除小鼠未注释小蛋白质表达基因MP31，导致其产生胶质瘤，生存期缩短【3】；而敲除小鼠未注释小蛋白质表达基因MLN，导致其肌肉细胞中钙泵SERCA活性增强，运动性能提高【4】。但是，至今只有十几个未注释小蛋白质被证实存在且有重要生物学功能，绝大多数仍处于预测阶段。有很多科学问题尚待解决：①这些未注释小蛋白质在细胞中能否被翻译成稳定的蛋白质？②是否广谱地有生物学功能？③如何被调控？

为了加速这一验证进程，鉴定有功能的未注释小蛋白质，2022年4月7日，耶鲁大学的博士后曹雄文（Slavoff教授课题组）在Nature Chemical Biology上发表了文章Nascent alt-protein chemoproteomics reveals a pre-60S assembly checkpoint inhibitor ，开发了新的化学蛋白质组学方法以鉴定蛋白质生成被调控的未注释小蛋白质，首次报道核糖体大亚基组装质量检测开关。

为了鉴定新生成未注释小蛋白质，研究人员利用甲硫氨酸类似物azidohomoalanine（AHA）标记上新生成的蛋白质，随后利用C8柱子富集小蛋白质，再利用点击化学富集标记上的新生成小蛋白质，最后利用质谱技术鉴定未注释小蛋白质。利用这个方法研究人员找到了22个未注释小蛋白质或N-端延长（N-terminal extension）的蛋白质。随后他们利用免疫荧光和Western blotting验证了其中6个未注释小蛋白质的表达，发现其中一个小蛋白质MINAS-60（Microprotein that Negatively regulates Assembly of the pre-60S ribosomal subunit）定位于核仁，编码于人RBM10基因编码区内部，是一类很少研究的Nested的未注释小蛋白质，因此研究人员决定对其进行深入研究。他们发现MINAS-60受细胞周期调控，且在小鼠中保守，暗示其有生物学功能。随后研究人员鉴定了MINAS-60的相互作用蛋白质，发现MINAS-60与核糖体大亚基pre-60S的4个组装因子相互作用，暗示其可能调控核糖体的生成。为了验证这一假设，研究人员利用puromycin incorporation实验检测了敲低MINAS-60对细胞整体蛋白质翻译的影响，发现敲低MINAS-60促进了细胞整体蛋白质的翻译水平。随后研究人员进行了机制研究，①利用qRT-PCR实验和Northern blotting实验，研究人员发现敲低MINAS-60不影响pre-rRNA的转录和加工；②利用confocal活细胞拍照和polysome profiling 技术，研究人员发现敲低MINAS-60降低细胞核中pre-60S的含量，而促进细胞质中60S的含量，提示敲低MINAS-60促进了核糖体大亚基pre-60S出细胞核；③利用定量质谱技术和Western blotting实验，研究人员发现敲低MINAS-60导致核糖体大亚基pre-60S复合体中组装因子含量增加，提示敲低MINAS-60促进了pre-60S的组装。

综上，研究人员开发了鉴定新生成未注释小蛋白质的化学蛋白质组学方法，功能研究了一类编码于已知蛋白质编码区内部 (Nested) 的未注释小蛋白质，并首次报道MINAS-60是一个核糖体大亚基组装质量检测开关。

Slavoff教授是本文的通讯作者，博士后曹雄文是本文的第一作者。该研究得到了Slavoff课题组和耶鲁大学Baserga课题组其他成员的支持和帮助。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41589-022-01003-9

1 Frith, M. C. et al. The abundance of short proteins in the mammalian proteome. PLoS genetics 2, e52, doi:10.1371/journal.pgen.0020052 (2006).

2 Lee, S. et al. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2424-2432, doi:10.1073/pnas.1207846109 (2012).

3 Huang, N. et al. An Upstream Open Reading Frame in Phosphatase and Tensin Homolog Encodes a Circuit Breaker of Lactate Metabolism. Cell metabolism 33, 128-144 e129, doi:10.1016/j.cmet.2020.12.008 (2021).

4 Anderson, D. M. et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell 160, 595-606, doi:10.1016/j.cell.2015.01.009 (2015).