耶鲁医学院学者揭示 EGFR 驱动的肺癌演进和药物治疗的遗传学机理 | Cancer Discovery
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关键词：
医学院药癌治疗机理遗传药物医学揭示
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发布时间：
2021-08-06
文献题目
：Genetic Determinants of EGFR-Driven Lung Cancer Growth and Therapeutic Response In Vivo
中文题目
：EGFR 驱动肺癌的演进及体内治疗反应的基因决定因素
在肺腺癌中，致癌基因 EGFR 突变与许多抑癌基因的改变共同发生，然而，这些基因的改变在多大程度上促进了肿瘤的生长和对体内药物治疗的反应仍然是未知的。
这项研究通过在体内模拟复杂的基因型改变，揭示了抑制 EGFR 突变肿瘤生长的关键抑制因子
。
此外，还发现 KEAP1 失活降低了肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。对肿瘤进化过程中基因改变后果的精确定位将有助于揭示癌变过程中特定改变的生物学和临床相关性，并识别可作为预防或克服耐药性治疗靶点的通路。
在肿瘤演进过程中，癌细胞的积累会导致癌基因和抑癌基因的改变，这些基因层面的改变有助于癌症的侵袭，也是区分不同类型癌症的重要依据，但目前经常基于单一致癌基因驱动突变的存在进行肿瘤分类，而同时发生的抑癌基因的改变在很大程度上被忽视。
在肺腺癌中，EGFR 和 KRAS 是两个最频繁突变的致癌驱动基因，TP53 在 EGFR 和 KRAS 驱动的肺腺癌中是最常见的突变的抑癌基因。更有趣的是，在 EGFR 和 KRAS 驱动的肺腺癌中，许多其他假定的抑癌基因以不同的频率发生突变，然而，这些改变在多大程度上促进了肿瘤生长以及它们对体内治疗的反应还没有实验研究，此外，这些在 EGFR 驱动下的抑癌基因在肺肿瘤中的功能重要性在很大程度上仍然是未知的。
来自耶鲁医学院的研究团队在 Cancer Discovery 发表了题为 Genetic Determinants of EGFR-Driven Lung Cancer Growth and Therapeutic Response In Vivo 的研究文章，他们通过整合一种新型的 EGFR 驱动的 Trp53 缺陷肺腺癌小鼠模型和多重 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑和肿瘤条形码测序 （Tumor barcoding sequencing, Tuba-seq），量化了 10 个公认的肿瘤抑制基因失活的效果。
前期的研究表明，在癌症基因工程小鼠模型中，可以使用慢病毒载体启动肿瘤，肿瘤条形码来定位克隆性，并递送慢病毒介导的 cDNA、shRNA 和 sgRNAs 来修饰肿瘤细胞。基于此，研究人员在 EGFR;p53 小鼠体内使用慢病毒载体启动肿瘤，并使用磁共振成像 （MRI） 监测肿瘤的发展。
8 周后
，EGFR;p53 小鼠首次检测到肿瘤；
11 周后
，肺组织学分析证实了多灶性肺腺癌的发展。因此，这种模型能够模拟人类致癌 EGFR 驱动的 TP53 缺陷肺肿瘤的遗传和组织病理学特征。
为了在 EGFR;p53 模型中实现体细胞基因组编辑，他们进一步加入了一个条件性 Cas9 等位基因。然后使用改进版本的 Tuba-seq 方法来量化癌基因 EGFR 驱动的肺肿瘤中的肿瘤抑制基因的功能。每个条码编码一个特定于 sgRNA 的 8 核苷酸 sgID 区域，然后是一个随机的 15 核苷酸条形码，因此，sgID-BC 区域的高通量测序可以从大体积肺肿瘤中量化每个基因型肿瘤的细胞数量。
同时，每个肿瘤中肿瘤细胞的绝对数量是通过唯一条码标准化的读取数来计算的。所以说，Tuba-Seq 可以实现在体内平行分析多个肿瘤抑制基因改变对肿瘤生长的影响。
随后，他们使用上述模型评估了 10 种在人类肺腺癌中经常发生改变的肿瘤抑制基因的功能。在肿瘤开始后的 11 周，当肿瘤在所有小鼠中都很容易检测到时，他们收集肺肿瘤组织进行 Tuba-seq 分析和组织学研究。
结果发现，Rb1、Apc 或 Rbm10 的失活最显著地促进了 EGFR 驱动的 Trp53 缺陷肺肿瘤的生长；相反，Lkb1 或 Setd2 的失活却显著降低了肿瘤的生长。这些结果表明，在特定情况下，被认为是肿瘤抑制基因的失活可能对癌症生长产生有害影响。其他肿瘤抑制基因，Atm, Arid1a, Cdkn2a 和 Keap1，在本实验中没有显著改变肿瘤的生长。
随后，他们对 Apc 和 rbm10 进行了进一步的实验验证，以确认这两种在之前研究中较少被涉及的肿瘤抑制因子在 EGFR 驱动肿瘤中的作用。他们设计了两个具有特异靶向 Rbm10 的 sgRNA，以增强研究结果的可靠性，这是因为在 EGFR 驱动的肺癌中，Rbm10 的肿瘤抑制作用仍然是不明确的。
结果发现，Apc 或 Rbm10 失活的小鼠产生的肿瘤显著大于对照组。这些结果进一步证实了这些肿瘤抑制基因在体内抑制 EGFR 驱动的肿瘤生长中的重要性。总之，
上述研究结果强调了 Tuba-seq、CRISPR-Cas9 介导的体细胞基因组编辑及慢病毒诱导的小鼠模型相结合的价值，它们在解析致癌基因 EGFR 驱动的肺腺癌中其他基因改变所致的生物学功能的改变具有非常强大的应用价值
。
基因工程小鼠模型为 EGFR 驱动的肺肿瘤生物学提供了重要的见解，并在研究 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药机制，特别是靶向耐药机制方面具有重要的价值。酪氨酸激酶抑制剂奥西替尼最近被批准用于 EGFR 驱动的肺腺癌的一线治疗，然而，参与调节药物作用的途径和对奥西替尼的耐药性机制仍在研究中。
为了研究肿瘤抑制基因如何影响肺肿瘤对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的治疗反应，研究团队在肿瘤起始 9 周后开始用奥西替尼治疗 EGFR 引发的肿瘤，为期 2 周。
为了量化灭活每个肿瘤抑制基因在体内对奥西替尼应答的影响，他们在肿瘤起始 11 周和 19 周后，对奥西替尼治疗的实验组小鼠的肺进行了 Tuba-seq，并将结果与药物治疗对照组的 Tuba-seq 结果进行比较。根据 Tuba-seq 的评估，
奥西替尼治疗大大降低了肿瘤负担，这与影像学数据和组织学分析是一致的
。不过，与药物治疗的小鼠相比，奥西替尼治疗 Keap1 失活引发的肿瘤并没有减少肿瘤大小或数量。
进一步的研究发现，Keap1 基因敲除小鼠中保留了 Keap1 蛋白的表达，也就是说在奥希替尼治疗期间，Keap1 中低表达可能是其耐药的原因。总的来说，尽管 Keap1 失活在 EGFR 驱动的肿瘤生长过程中没有被积极选择，但却是限制奥西替尼治疗反应的因素之一。
最后，为了研究发现与临床数据相关联，他们分析了在 EGFR/TP53 突变的肺腺癌中，KEAP1 通路改变对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂治疗患者预后的影响。
结果发现，与 KEAP1/NFE2L2/CUL3 野生型肿瘤匹配患者相比，KEAP1/NFE2L2/CUL3 通路突变与 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂治疗失败时间的显著缩短相关。在其他几个肿瘤抑制基因型中，经过多重假设检验校正后，KEAP1 通路的改变也是限制敏感性的最重要驱动因素。
综上所述，本研究将 CRISPR-Cas9 介导的体细胞基因组编辑和肿瘤条形码测序 （Tuba-seq）与一种新的 EGFR 驱动的 Trp53 缺陷肺癌基因工程小鼠模型耦合，系统评估了 EGFR 驱动背景下，肺腺癌中常见改变的 10 个抑癌基因失活的适应度效应，并揭示了在不同的致瘤环境中，特定的肿瘤抑制基因对肿瘤生长和体内对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂奥西替尼的敏感性有不同的作用。
这项研究提供了明确的定量数据来描述基因改变的互斥性和协同生物学效应，同时还探讨了抑癌基因和其他共发生突变基因之间的复杂相互作用关系，因此具有重要的临床意义，对揭示癌变过程中特定改变的生物学和临床相关性，并识别可作为预防或克服耐药性治疗靶点的通路具有重要提示作用。
文章链接：https://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/11/7/1736
参考文献
1. Foggetti G, et.al. Genetic Determinants of EGFR-Driven Lung Cancer Growth and Therapeutic Response In Vivo. Cancer Discov. 2021 Mar 11. doi: 10.1158/2159-8290.CD-20-1385.
2. Rogers, Z. N. et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods 14, 737–742, doi:10.1038/nmeth.4297 (2017).
3. Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144, 646–674, doi:10.1016/j.cell.2011.02.013 (2011).
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